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La Deparaffinazione dei vetrini È un passaggio è necessario quando si utilizzano sezioni incluse in paraffina. Prima di procedere con il protocollo di colorazione, i vetrini devono essere deparaffinati, mediante passaggi in soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti di acqua, e reidratati. L’incompleta rimozione della paraffina può portare a una scarsa colorazione della sezione. I reagenti occorrenti sono: xilene. Etanolo al 100%. Etanolo al 95%. Etanolo al 70%. Etanolo al 50%. Ed acqua. Immergere i vetrini in Xilene per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere nuovamente i vetrini in Xilene per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere i vetrini in Xilene: 100% etanolo in rapporto 1:1 per 3 minuti a temperatura ambiente Disidratare i vetrini in EtOH al 100% per 3 minuti a temperatura ambiente. Disidratare nuovamente i vetrini in EtOH al 100% per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere i vetrini in EtOH al 95% per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere i vetrini in EtOH al 70% per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere i vetrini in EtOH al 50% per 3 minuti a temperatura ambiente. Immergere più volte i vetrini in acqua fredda per risciacquare. Conservare i vetrini nell'acqua del rubinetto fino a quando non si è pronti per il recupero dell'antigene. Da questo momento in poi i vetrini devono rimanere sempre idratati. L'essiccazione causerà un legame anticorpale non specifico e quindi un'elevata colorazione di fondo. Le soluzioni di smascheramento dell'antigene sono altamente efficaci nel rivelare gli antigeni in sezioni di tessuto fissate in formalina, o incluse in paraffina quando usate in combinazione con una procedura di trattamento ad alta temperatura. Le soluzioni di smascheramento dell'antigene diluito sono progettate per l'uso in procedure di smascheramento ad alta temperatura dopo aver deparaffinato e reidratato le sezioni in acqua distillata. Versare 500 ml di acqua distillata in un becher e aggiungere 5 ml di stock Antigen Unmasking Solution (da agitare bene prima dell'uso). Immergere i vetrini (deparaffinati e reidratati) nella soluzione dopo averla agitata, coprire, ma non bloccare completamente la copertura. Immergere il becher in un bagnetto a 100°C per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere in becher dal bagnetto e lasciar raffreddare a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in tampone PBS (pH 7,5) per 5 minuti. Seguire il protocollo standard di immunoistochimica. La Colorazione immunoistochimica prevede l’utilizzo di due kit Uno è l’ ImmPRESS® Horse Anti-Rabbit IgG reagent kit, l’altro è l’ ImmPRESS® Goat Anti-Mouse IgG reagent kit. Il kit è un sistema enzimatico di amplificazione senza biotina che produce una colorazione nitida, altamente sensibile e specifica con bassa colorazione di fondo. I reagenti nel kit ImmPRESS sono pronti per l'uso Tracciare con pennarello idrorepellente le sezioni e lavorare a goccia. Se è necessario estinguere l'attività della perossidasi endogena, incubare le sezioni in H2O2 al 3% in PBS per 10 minuti. Lavare in tampone PBS 1X per 5 minuti. Lavare nuovamente in tampone PBS 1X per 5 minuti. Incubare le sezioni per 20 minuti con Normal Horse Serum (oppure Normal Goat Serum), 2,5%. Eliminare il siero in eccesso dalle sezioni. Incubare con Ab I diluito opportunamente nel siero, per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare in tampone PBS 1X per 5 minuti. Lavare nuovamente in tampone PBS 1X per 5 minuti. Lavare un’ultima volta in tampone PBS 1X per 5 minuti. Incubare per 30 minuti con ImmPRESS reagent (AbII). Lavare in tampone PBS 1X per 5 minuti. Lavare nuovamente in tampone PBS 1X per 5 minuti. Lavare un’ultima volta in tampone PBS 1X per 5 minuti. Combinare una goccia (circa 30 microl) di ImmPACT DAB in 1 ml di diluente e miscelare bene. Incubare le sezioni nella soluzione di lavoro ImmPACT DAB EqV fino alla colorazione desiderata (tra 2 e 10 minuti, il tempo viene stabilito per ogni diverso anticorpo). Sciacquare le sezioni (i vetrini) con acqua di rubinetto per 3 volte. Controcolorare (opzionale), con ematossilina (Gill’s Hematoxylin 1). Sciacquare le sezioni (i vetrini) con acqua di rubinetto per 3 volte. Montare il coprioggetto sul vetrino. Lasciar cadere una/due gocce di montante (VectaMount AQ Mounting Medium) sulle sezioni e successivamente adagiarvi il coprioggetto (eventualmente picchiettare sullo stesso per favorire la fuoriuscita delle bolle e la dispersione del montante sul vetrino).