Read Aloud the Text Content

This audio was created by Woord's Text to Speech service by content creators from all around the world.

Text Content or SSML code:

Tematem prezentacji są białka fluorescencyjne. Pierwszym odkytym białkiem fluorescencyjnym było białko zielonej fluorescencji GFP które zostało pierwotnie odkryte w meduzie Aequorea victoria w latach sześćdziesiątych dwudziestego wieku. Białko zielonej fluorescencji (GFP) oraz inne białka fluorescencyjne stanowią niezwykle użyteczne narzędzia w modyfikacjach genetycznych organizmów. Tworzenie tak zwanych białek fuzyjnych, poprzez połączenie genu kodującego GFP z genem kodującym inne białko, otwiera nowe możliwości badawcze. Białko fuzyjne, będące hybrydą GFP i badanego białka, wykazuje fluorescencję w kolorze zielonym po naświetleniu światłem niebieskim lub UV. Jego główną zaletą była możliwość obserwacji w żywej komórce w czasie rzeczywistym w przeciwieństwie do np. immunolokalizacji która była stosowana wcześniej do lokalizacji białek w komórce za pomocą znakowanego przeciwciała. Zastosowanie tej metody wymagało utrwalenia komórki i naruszenia jej ciągłości by wprowadzić przeciwciało ,co uniemożliwia obserwacje w czasie rzeczywistym i mogło wpływac na wynik takiej obserwacji więc wprowadzenie białek fluorescencyjnych znacznie ulepszyło obserwację mikroskopowe. Jeżeli chodzi o wady to zastosowanie tych białek także wiąże się ze zjawiskiem fotoblaknięcia czyli utratą zdolności emisji fluorescencji co oznacza, że preparaty są możliwe do obserwacji przez daną ilość czasu, co ogranicza czas trwania eksperymentu. Jak to się dzieje ze białka emituja swiatlo? Białko fluorescencyjne zawiera chromofor, który jest zdolny do pochłaniania światła. Gdy białko jest naświetlone światłem o odpowiedniej długości fali (zwykle krótszej niż fala światła widzialnego)- chromofor przechodzi do stanu wzbudzonego, pobierając energię. Ekscytacja do Stanu Wzbudzonego: Po pochłonięciu energii, chromofor przechodzi do stanu wzbudzonego, co oznacza, że znajduje się na wyższym poziomie energetycznym niż w stanie podstawowym. Emisja Fluorescencji: Aby powrócić do stanu podstawowego, chromofor emituje energię w postaci światła o dłuższej fali (zwykle w zakresie światła widzialnego). Ten emitowany światłowidoczny jest tym, co obserwujemy jako fluorescencję. Ogólnie chromoforem jest zwykle jeden z dwóch układów: układ sprzężonych wiązań (orbitali) π lub związek kompleksowy metalu. Wiele białek fluorescencyjnych, w tym GFP, posiada charakterystyczną strukturę β-beczułki. Jest to cylindryczna baryłka złożona z jedynasto-strunowej β-kartki. Chromofor jest osadzony wewnątrz tej struktury. Struktura białka fluorescencyjnego może również zawierać helisy, które mogą otaczać β-beczułki co gra role w utrzymaniu stabilności całej struktury. Jako że białko GFP odniosło sukces to rozpoczęto prace nad rożnymi wariantami tych białek. Pierwszym takim ulepszonym białkiem było EGFP uzyskane w wyniku wymiany dwóch aminokwasów białka GFP, co pozwoliło na uzyskanie wyższej intensywności fluorescencji oraz obniżoną tendencje do agregacji. Jako iż znany był tylko zielony znacznik rozpoczęto prace nad uzyskaniem znaczników o innych barwach wprowadzając różne mutacje w białko GFP i tak otrzymano białka BFP emitujące kolor niebieski, CFP emitujący niebiesko-zielony, YCP –żółty a mczerry –czerwony. Występują różne modyfikacje tych białek w tym: Białka Fotoaktywowalne których Modyfikacja ta polega na zdolności białka do programowanego włączenia. Polega to na tym że poprzez zastosowanie krótkiego impulsu światła powodowana jest zmiana konformacji białka, i białko przełącza się ze stanu niefluorescencyjnego do stanu fluorescencyjnego. Ta modyfikacja jest używana w mikroskopii do dokładnej kontroli czasu i miejsca fluorescencji w próbce. Następnym przykładem są białka Fotokonwertowalne które W przeciwieństwie do białek fotoaktywowalnych , białka fotokonwertowalne już emitują fluorescencje. Pod wpływem stymulacji wiązką o odpowiedniej długości maksimum emisji przesuwa się powodując zmiane barwy. W mikroskopii umożliwiają one dokładną kontrolę barwy fluorescencji i dostarczanie informacji na temat dynamicznych procesów wewnątrz komórek. Następnym typem są Białka fotoprzełączalne które W przeciwieństwie do poprzednich typów są odwracalne pomiędzy dwoma stanami. Białko nieaktywne fluorescencyjnie naświetla się światlem o danej długości co prowadzi do aktywacji fluorescencyjnej białka, a następnie ponowna stymulacja falą o innej długości powoduje powrót do poprzedniego stanu. Zdolność do precyzyjnej kontroli czasu emisji fluorescencji pozwala na dokładne monitorowanie dynamicznych procesów wewnątrz komórek, ponieważ badacze mogą wybierać momenty aktywacji i dezaktywacji białka oraz umożliwiają uzyskanie bardzo wysokiej rozdzielczości przestrzennej poprzez selektywne aktywowanie i dezaktywowanie fluoroforów. Jak można zastosować znaczniki fluorescencyjne w badaniach? Jedną z takich zastosowań jest badanie za pomocą techniki frap czyli z angielskiego Fluorosens Rekowery After Photobliczning .Służy ona do badania dynamiki białek. Polega na tym że pewien obszar komórki poddajemy działaniu silnego światła laserowego, co spowoduje uszkodzenie metki fluorescencyjnej, lecz nie białka, do którego metka była przyłączona. Jeśli białko jest dynamiczne i będzie się poruszać, to fluorescencja powróci, ponieważ do badanego obszaru zaczną napływać inne białka ze znacznikiem, jeśli jednak białko nie jest dynamiczne to sygnał fluorescencyjny nie powróci, ze względu na to, że metka w nieporuszających się białkach została zniszczona przez działanie lasera. Technika ta jest stosowana w żywych preparatach. co za tym idzie Wysokie natężenie światła używane do fotobleachingu może potencjalnie uszkadzać komórki, co może prowadzić do efektów artefaktów oraz W przypadku bardzo małych cząsteczek lub cząsteczek o bardzo szybkiej dyfuzji, interpretacja wyników frap może być trudniejsza. Następnym przykładem jest technika flip z angielskiego Fluorescens Loss in Photobliczing. Technika Flip jest bardzo podobna do techniki Frap i polega na tym że Świecimy mocnym światłem na połowę komórki, a obserwacje prowadzimy na drugiej połowie, która była nieoświetlona. Ten proces powtarzamy kilka razy tak aby upewnić się ze wszystkie białka są wyblaknięte. Więc tam, gdzie nie świecono,a obserwuje się fluorescencję, tam zaobserwowano nieruchliwe elementy. Proces ten jest używany do dynamiki białek, badania transportu jądro-cytoplazma czy badanie ruchliwości dwuwarstwylipidowej. Dziękuje bardzo za uwagę.